染色体複製開始タンパク質の機能制御因子とその作動メカニズムの解析
片山 勉
本研究計画では、複製開始に関わる制御システムの分子機構とネットワークを明らかにするため、大腸菌の複製開始タンパク質DnaAの機能制御メカニズムを解析した。大腸菌細胞内では、通常、不活性型のADP-DnaAが活性型のATP-DnaAより高濃度で存在する。複製開始前特異的にATP-DnaA濃度が上昇し、ADP-DnaA濃度を超える。このことは過去に解明した（EMBO J. 1999）が、DnaA活性化因子の実体は不明であった。本研究で初めて、ゲノム上のDNA因子がDnaAのヌクレオチド交換を進め、ADP-DnaAをATP-DnaAに変換することが解明された（文献１）。このDNA因子をDARS(DnaA-Reactivating Sequence)と命名した。DARS欠失株では、ATP-DnaA濃度が高まらず、複製開始タイミングが遅延した。DARSは複数のDnaAと直接結合し特異的な多量体を形成させる。このときDnaAの構造変化がもたらされヌクレオチド交換が進むと思われる。DARS機能の制御因子の存在も明らかになっている。
ATP-DnaA分子は複製起点(oriC)上で多量体を形成して、複製開始複合体を形成する。この複合体には、新規因子DiaAが含まれることがわかった（文献４）。DiaAはホモ四量体を形成し複数のDnaA分子を繋ぎ止める。これによって、DnaA多量体形成を促進している。さらにDnaAからDiaAを解離させる新たな制御因子の存在も明らかになった（文献２）。DiaA解離は、oriC ２重鎖開裂後のヘリカーゼ装着過程に必要となると思われる。細胞内DiaA動態解析からもこれらの解析と一致する結果が得られている（仁木班との共同研究）。
複製開始後、DNAポリメラーゼIIIホロ酵素によりDNA合成が進められる。この過程でDNA上に装着されたクランプ因子（PCNAオーソログ）とHdaタンパク質により、DnaA-ATP加水分解が進められ、ADP-DnaA濃度が高まる。この制御系は過剰開始抑制に必須であり、過去にRIDA（Regulatory Inactivation of DnaA）と命名した(Cell, 1998; EMBO J., 2001)。本研究では、Hdaとの相互作用によるDnaA-ATP加水分解のメカニズムを解明した（文献５）。さらに、HdaがADP結合により活性化されることを解明した（文献３）。HdaのADP結合を制御する因子の存在も明らかになった。今後、本研究から見いだされた新規因子（DARS制御、DiaA制御、Hda制御）について解析を進めたい。
代表的文献
1. Fujimitsu, K., Senriuchi, T., and Katayama, T. (2009). Specific genomic sequences of E. coli promote replicational initiation by directly reactivating ADP-DnaA. Genes Dev. 23, 1221-1233
2. Keyamura, K., Abe, Y., Higashi, M., Ueda, T., and Katayama, T. (2009). DiaA dynamics are coupled with changes in initial origin complexes leading to helicase loading. J. Biol. Chem. 284, 25038-25050
3. Su'etsugu, M., Nakamura, K., Keyamura, K., Kudo, Y., and Katayama, T. (2008). Hda monomerization by ADP binding promotes replicase clamp-mediated DnaA-ATP hydrolysis. J. Biol. Chem. 283, 36118-36131
4. Keyamura, K., Fujikawa, N., Ishida, T., Ozaki, S., Su'etsugu, M., Fujimitsu, K., Kagawa, W., Yokoyama, S., Kurumizaka, H., and Katayama, T. (2007). The interaction of DiaA and DnaA regulates the replication cycle in E. coli by directly promoting ATP-DnaA-specific initiation complexes. Genes Dev. 21, 2083-2099
5. Su'etsugu, M., Shimuta, T., Ishida, T., Kawakami, H., and Katayama, T. (2005). Protein associations in DnaA-ATP hydrolysis mediated by the Hda-replicase clamp complex. J. Biol. Chem. 280, 6528-6536