研究概要

キーワード;染色体複製開始、高次複合体、試験管内再構成、細胞周期制御、ゲノム機能、システム相互作用

 細胞増殖過程ではゲノム複製によって遺伝情報のコピーが作られ、それぞれ娘細胞に伝達される。この際、ゲノム複製はただ1回だけ起こることによって、遺伝情報を正確に2倍化する。このゲノム複製の「1回性」は細胞性生物に共通かつ必須の制御システムである。もしこの制御が欠損すると、複製コピーの不足や過剰が生じる。このような分子病態は染色体異常や細胞増殖阻害などを誘起する(図1)。ゲノム複製の基本システムは進化過程で高度に保存されている(図2)ので、我々はモデル系とし大腸菌を用い、1回性複製の維持制御メカニズムを解析している。

(図1) (図2)

 大腸菌染色体におけるDNA複製の開始反応はDnaA蛋白質が中心になって行われ、最終的に、DNAポリメラーゼIIIをDNA上に結合させる(図3)。最近我々はDNAに結合したDNAポリメラーゼIIIのβサブユニット(スライディングクランプ または βクランプ(clamp))によって、開始反応遂行後のDnaA蛋白質が直接、不活性化されることを見出した(図4)。

(図3) (図4)

 すなわち、DNA複製プロセスの進行は、DNAポリメラーゼの動態変動によってシグナル化され、複製開始因子に直接伝えられることがわかったのである。このフィードバック型制御系によって、複製開始スイッチが適時的にOFFになることが、1回のみの複製開始反応を保証する主要な制御系となっている。(図5)
 現在、RIDAシステムと命名したこの制御系の反応機構と制御機構とを生化学的・分子生物学的手法で解析を深めている。さらにRIDA機構や複製開始反応を蛋白質構造から説明できるよう、DnaA蛋白質、Hda蛋白質などの機能構造および立体構造解析を試みている(共同研究含む)。
 さらにゲノム上のdatA部位には、ATP-DnaAと相互作用してそのATP加水分解を進めRIDAを補助する機構が備わっていることも新たに解明した(図6)。 

 また、ADP-DnaAをATP結合型に変換することによるDnaA再活性化機構、細胞周期と同調して複製スイッチをONにする分子機構、DNA複製と細胞分裂との共役機構、等の研究を進行させている。なかでも、DnaA再活性化機構では、最近、ADP 解離因子を解明し、DARS (DnaA-Reactivating Sequence)と命名した(図5, 6)。DARS はゲノム上の非コード領域に存在するDNA因子であり、DnaAと直接相互作用する。これらの研究は細菌の増殖制御機構の解明に役立つのみならず、ガンや染色体異常の発生機構の解明やこれらに対する薬物設計に役立つことが期待される。

(図5)
(図6)

  また、上記(図3)で概観したように、染色体DNAの複製開始反応には、高次で複合的なタンパク質多量体の形成、および、タンパク質複合体の機能的構造変化がキーとなっている。大腸菌では最少限、DnaAタンパク質1種のみが複製起点oriC上で高次複合体を形成することにより、開始反応が引き起こされる。oriCを含むDNAを用いて試験管内で複製開始反応を再構成することもできる。よって大腸菌のシステムには、このキー反応の原理解明にとても有利な条件が備わっている。開始反応過程では、通常、溶液中ではモノマー(単量体)であるATP結合型DnaAタンパク質がoriC上で機能的多量体を形成する。我々は、このoriC-DnaA多量体(複製開始複合体)の構造機能解析を進め、複製開始反応の分子メカニズムの解明に挑戦している。まず、我々は複製開始複合体において、ATP結合を認識するDnaAアミノ酸残基の同定に成功した。これに基づき、ATP依存的に複製開始が起こるメカニズムをすでに提案している。次に、oriC内には親和性の異なる複数のDnaA結合部位があり、DnaA分子の共同的結合の制御に関わっている。我々が見いだした新規DnaA結合因子DiaAタンパク質は、oriC上での低親和性部位へのATP-DnaA装着を補助し、ATP-DnaA多量体形成を促進する役割をもつことがわかった。さらに、形成されたoriC-ATP-DnaA複合体中では2重鎖DNAの開裂(局所的1本鎖化)反応が起こる。最近、2重鎖開裂(1本鎖DNAとの結合)反応に特異的に必要とされるDnaAアミノ酸残基の同定にも成功した。このようなことから複製開始複合体の形成と作動のメカニズムを解明しつつある。

    

主要原著論文
下線は片山および2002年以降の当分野教員(または元教員)

Shimizu, M., Noguchi, Y., Sakiyama, Y., Kawakami, H., Katayama, T.* and Takada, S.* (*Co-corresponding authors) (2016)
Near-atomic structural model for bacterial DNA replication initiation complex and its functional insights
Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2016) doi:10.1073/pnas.1609649113
(複製開始複合体の精密構造を計算機シミュレーションと生化学解析との融合研究により可視化)

Noguchi, Y. and Katayama, T. (2016)
The Escherichia coli cryptic prophage protein YfdR binds to DnaA and initiation of chromosomal replication is inhibited by overexpression of the gene cluster yfdQ-yfdR-yfdS-yfdT
Front. Microbiol. 7; 239. (21 pages) doi: 10.3389/fmicb.2016.00239
(DnaA-DnaBヘリカーゼ相互作用およびDnaA-DiaA相互作用を阻害する新規タンパク質因子の発見)

Noguchi, Y., Sakiyama, Y., Kawakami, H., and Katayama, T. (2015)
The Arg fingers of key DnaA protomers are oriented inward within the replication origin oriC and stimulate DnaA subcomplexes in the initiation complex
J. Biol. Chem. 290(33);20295-20312 doi: 10.1074/jbc.M115.662601 (大腸菌の複製開始複合体におけるDnaA複合体の動態構造の発見)

Kawakami, H., Ohashi, E., Kanamoto, S., Tsurimoto, T., and Katayama, T. (2015)
Specific binding of eukaryotic ORC to DNA replication origins depends on highly conserved basic residues
Sci. Rep. 5; 14929 (14 pages) (真核生物の複製開始複合体ORCのDNA認識機構の発見)

Kasho, K., Fujimitsu, K., Matoba, T., Oshima,T., and Katayama, T. (2014)
Timely binding of IHF and Fis to DARS2 regulates ATP-DnaA production and replication initiation
Nucleic Acids Res. 42(21):13134-13149 doi: 10.1093/nar/gku1051 (細胞周期と共役したDARS2活性化の発見)

Ozaki, S., Matsuda, Y., Keyamura, K., Kawakami, H., Noguchi, Y., Kasho, K., Nagata, K., Masuda, T., Sakiyama, Y., and Katayama, T. (2013)
A replicase clamp-binding dynamin-like protein promotes colocalization of the nascent DNA strands and equipartitioning of chromosomes in E. coli
Cell Reports 4(5):985-995(http://dx.doi.org/10.1016/j.celrep.2013.07.040)(クランプ結合型DNA接着因子の発見)

Kasho K., and Katayama,T. (2013)
DnaA-binding locus datA promotes DnaA-ATP hydrolysis to enable cell cycle-coordinated replication initiation
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110, 946-941(DDAHの発見)

Ozaki, S., Noguchi, Y., Hayashi, Y., Miyazaki, E., and Katayama, T. (2012)
Differentiation of the DnaA-oriC sub-complex for DNA unwinding in a replication initiation complex
J. Biol. Chem. 287(44), 37458-37471 (大腸菌の複製開始複合体におけるDnaA複合体の基盤構造の発見)

Ozaki, S., and Katayama, T. (2012)
Highly organized DnaA-oriC complexes recruit the single-stranded DNA for replication initiation
Nucleic Acids Res. 40(4), 1648-1665 (大腸菌の複製開始複合体における2重鎖開裂機構の解明)

Fujimitsu, K., Senriuchi, T., and Katayama, T. (2009)
Specific genomic sequences of E. coli promote replicational initiation by directly reactivating ADP-DnaA
Genes Dev. 23(10): 1221-1233 (Perspectives, 23(10):1145-50) (DARS の発見)

Keyamura, K., Abe, Y., Higashi, M., Ueda, T., and Katayama, T. (2009)
DiaA dynamics are coupled with changes in initial origin complexes leading to helicase loading
J. Biol. Chem. 284(37): 25038-25050

Su'etsugu, M., Nakamura, K., Keyamura, K., Kudo, Y., and Katayama, T. (2008)
Hda monomerization by ADP binding promotes replicase clamp-mediated DnaA-ATP hydrolysis
J. Biol. Chem. 283 (54), 36118-36131

Ozaki, S., Kawakami,H., Nakamura, K., Fujikawa, N., Kagawa, W., Park, S.-Y., Yokoyama, S., Kurumizaka, H., and Katayama, T. (2008)
A common mechanism for the ATP-DnaA-dependent formation of open complexes at the replication origin
J. Biol. Chem. 283(13), 8351-8362 (大腸菌のDnaAの1本鎖DNA結合部位の発見:2重鎖開裂複合体の基盤構造の解明)

Keyamura, K., Fujikawa, N., Ishida, T., Ozaki, S., Su'etsugu, M., Fujimitsu, K., Kagawa, W., Yokoyama, S., Kurumizaka, H., and Katayama, T. (2007)
The interaction of DiaA and DnaA regulates the replication cycle in E. coli by directly promoting ATP-DnaA-specific initiation complexes
Genes Dev.
21, 2083-2099 (新規因子DiaAによる複製複合体の形成促進とその分子機構の解明)

Abe, Y., Jo, T., Matsuda, Y., Matsunaga, C., Katayama, T., and Ueda, T. (2007)
Structure and function of DnaA N-terminal domains: Specific sites and mechanisms in inter-DnaA interaction and in DnaB helicase loading on oriC
J. Biol. Chem. 282(24),17816-17827 JBC Paper of the Week  (DnaAドメイン I の立体構造の解明:DnaBヘリカーゼとの相互作用機構の解明)

Kawakami, H., Keyamura, K., and Katayama, T. (2005)
Formation of an ATP-DnaA-specific initiation complex requires DnaA arginine-285, a conserved motif in the AAA+ protein family
J. Biol. Chem. 280(29), 27420-27430  (複製開始複合体におけるDnaA-DnaA相互作用機構とATP認識機構の解明)

Su'etsugu, M., Shimuta, T., Ishida, T., Kawakami, H. and Katayama, T. (2005)
Protein associations in DnaA-ATP hydrolysis mediated by the replicase clamp-Hda complex
J. Biol. Chem. 280(8), 6528-6536  (RIDAにおけるHdaの分子機構の解明)

Ishida, T., Akimitsu, N., Kashioka, T., Hatano, M., Kubota, T., Ogata, Y., Sekimizu, K., and Katayama, T. (2004)
DiaA, a novel DnaA-binding protein, ensures the initiation timing of E. coli chromosome replication
J. Biol. Chem. 279(44), 45546-45555  (新規な複製開始制御因子DiaAの発見)

Fujikawa, N., Kurumizaka, H., Nureki, O., Terada, T., Shirouzu, M., Katayama, T., and Yokoyama, S. (2003)
Structural basis of replication origin recognition by the DnaA protein.
Nucleic Acid Res. 31(8), 2077-2086  (DnaAドメインIV-DNA複合体の立体構造の解明)

Nishida, S., Fujimitsu, K., Sekimizu, K., Ohmura,T., Ueda, T., and Katayama, T.(2002)
A nucleotide switch in E.coli DnaA protein initiates chromosomal replication: Evidence from a mutant DnaA protein defective in regulatory ATP hydrolysis in vitro and in vivo.
J.Biol.Chem. 277(17),14986-14995

Kato,J. and Katayama, T.(2001)
Hda,a novel DnaA-related protein,regulates the replication cycle in Escherichia coli.
EMBO J. 20(15),4253-4262

Kurokawa, K., Nishida, S., Emoto, A., Sekimizu, K.,and Katayama, T.(1999)
Replication cycle-coordinated change of the adenine nucleotide-bound forms of DnaA protein in Escherichia coli.
EMBO J. 18(23),6642-6652

Katayama, T., Kubota, T., Kurokawa, K., Crooke, E.,and Sekimizu, K.(1998)
The initiation function of DnaAprotein is negatively regulated by the sliding clamp of the E. coli chromosomal replicase.
Cell 94(1),61-71

Katayama, T., and Crooke, E. (1995).
DnaA protein is sensitive to a soluble factor and is specifically inactivated for initiation of in vitro replication of the Escherichia coli minichromosome.
J. Biol. Chem. 270 (16), 9265-9271.

Katayama, T. (1994).
The mutant DnaAcos protein which overinitiates replication of the Escherichia coli chromosome is inert to negative regulation for initiation.
J. Biol. Chem. 269 (35), 22075-22079.

Katayama, T., and Kornberg, A. (1994).
Hyperactive initiation of chromosomal replication in vivo and in vitro by a mutant DnaA protein, DnaAcos, of Escherichia coli.
J. Biol. Chem. 269 (17), 12698-12703

主要総説
Skarstad, K. and Katayama, T. (2013)
Regulating DNA Replication in Bacteria
In "DNA Replication", Edited by Bell, S.D., Me'chali, M, and DePamphilis, M.L., Cold Spring Harbor Laboratory Press

Katayama, T., Ozaki, S., Keyamura, K. and Fujimitsu, K. (2010)
Regulation of the replication cycle: Conserved and diverse regulatory systems for DnaA and oriC
Nature Rev. Microbiol. 8(3):163-170

Kawakami, H. and Katayama, T. (2010)
DnaA, ORC, and Cdc6: Similarity beyond the domains of life and diversity
Biochem. Cell Biol. 88(22): 49-62

Ozaki, S., and Katayama, T. (2009)
DnaA structure, function, and dynamics in the initiation at the chromosomal origin
Plasmid 62: 71- 82

Katayama, T.(2001)
Feedback controls restrain the initiation of Escherichia coli chromosomal replication.
Mol.Microbiol.41(1),9-18.

片山 勉(2011)
高次制御機構を備えた新たなゲノム複製系の再構成に向かって
実験医学「細胞を創る・生命システムを創る」 羊土社
29巻7号(増刊)、83-89頁

片山 勉(2009)
大腸菌の染色体複製開始制御機構
蛋白質核酸酵素3月号増刊「染色体サイクル:ゲノムの恒常性維持、継承とダイナミクス」 共立出版
54巻4号、343-349頁

片山 勉(2007)
複製再開始抑制の分子機構
実験医学、25巻5号(増刊「染色体サイクル」)、49-55頁、羊土社

片山 勉(2002)
「VII章 染色体複製の制御、2.1 原核生物における複製制御」
松影昭夫・正井久夫編「ゲノムの複製と分配」(2002年10月)
シュプリンガーフェアラーク東京

片山 勉(1999)
DNAポリメラーゼの新機能:染色体複製開始の負の制御
蛋白質核酸酵素 44巻、7号、845-853頁(1999年6月号)


国際的教科書への引用

Benjamin Lewin "GENES"
Genes VIII (2004)
 CHAPTER 14  DNA Replication
  p410-411  RIDAの解説 (当研究室発信の論文3編も引用されている)

Lehninger "Principles of Biochemistry"
RIDAが記載されている

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